让细胞活下来的最小基因组，来自人工合成！

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2010年，当辛西娅（Synthia）顶着“人造生命”的光环进入人们的视野时，世界沸腾了。分子克隆技术问世40年后，科学家们仿佛终于扮演了一回上帝的角色，构造出从未存在过的生命形式。
辛西娅既无法欣赏自己的名字，也意识不到自己给人类带来了多大的震撼——它是一种细菌。六年前，克雷格·文特尔（Craig Venter）和他的团队以丝状支原体（Mycoplasma mycoides）的基因组作为模板，化学合成出一整套支原体的基因组，并将它移植到除去了DNA的山羊支原体（Mycoplasma capricolum）细胞内。这套人工合成的基因组最终指导它所在的细胞活了下来，喜出望外的研究者给了它一个必将被铭记的名字：辛西娅。
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0 u0 s9 z" \3 I" S3 B# q6 m克雷格·文特尔（Craig Venter）作为封面的杂志，标题写着“扮演上帝”。图片来源：origos.hu
尽管被当成扮演上帝的人，但作为生物学家的文特尔，看待自己的创造并不带任何神学色彩。在他看来，生物的基因组就好比一份系统软件，基因测序技术的发展使人们能够“阅读”生命在亿万年的时间演化出的种种“代码”。而辛西娅的出现，证明了人类也可以自己码一套能用的系统软件。
& `) B5 L4 w5 v- I/ y但这只是刚刚开始。文特尔真正希望做到的，是透过无数个版本的代码看到软件运行的本质——在基因组中抽丝剥茧，提炼出生命之所以能成为生命的基石。为此，辛西娅不能止步于辛西娅。从诞生的那一刻起，它便只是“辛西娅1.0”。生来便是为了向辛西娅2.0迈进。
辛西娅2.0：刷新最小基因组纪录的微生物辛西娅1.0的诞生并不容易。它的基因组有901个基因，超过100万个碱基对（bp），没有办法一次合成。以当时的技术，文特尔和同事只能选择分段分步合成。利用大肠杆菌和酿酒酵母这两种常见的模式生物作为宿主，他们将合成了1078条大约1000bp的DNA片段，然后组装成辛西娅的基因组（Syn1.0）。
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辛西娅（Synthia）的诞生：1078条DNA片段分布组合成一条长达1078809bp的人工基因组。图片来源：wordpress.com
在能自主复制的细胞中，身为支原体的辛西娅已经有着很小的基因组。为了在不同环境中活下来，细菌通常会携带很多具备不同功能的基因来应对环境变化，走哪打哪的大肠杆菌就有大约4000个基因。相比之下，在动物宿主体内吃饱穿暖的支原体，则在漫长的演化年月里丢弃了那些在稳定环境中派不上用场的基因。早在20年前，文特尔就知道在所有可自我复制的细胞中，已知最小的基因组来自生殖支原体（Mycoplasma genitalium）——它仅仅包括525个基因。20年后，辛西娅的基因组能不能精简到比它更小？
: K  b. B% H( V4 ]. p带着这样的问题，文特尔和生物化学家克莱德•赫钦森（Clyde A. Hutchison III）等人开始了简化辛西娅“代码”的旅程。目标只有一个：得到一个能够支持辛西娅完成生存的最小基因组（minimal genome）。
怎么做？把辛西娅体内那些被删了也不会致死的基因删掉，把删了就活不下去的基因留下。完事。听起来很简单明了，可是，哪些基因是可以删的呢？
文特尔等人设计了这样一个实验：随机往Syn1.0上的基因插入转座子（一类DNA序列），使原来的基因失活——原本的“代码”被打乱。之后，他们将处理后的辛西娅菌株培养40代，最终收集得到的菌落，分别进行测序。此时，辛西娅的基因被分为以下三种情况：

• 如果一个基因同时在第一代和最后一代都“健在”，就表示这个基因不能缺——它们都是幸存者。这个基因失活的辛西娅，都活不到被收集那一代，所以它是“必需基因”；
         
• 如果一个基因在第一代和最后一代都是失活的，证明这一基因可以被敲除——有它没它都不会影响支原体的生长，所以它是“非必需基因”；
         
• 如果一个基因在第一代被失活了，到在最后一代却好好的，证明这一基因既重要又不是至关重要——没有它辛西娅不会死，但影响宿主的代谢状态，减缓生长速度。这样的基因被分类为“半必需基因”。
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按照这样的分类，在Syn1.0上的必需基因有240个，非必需基因有432个，半必需基因有219个。好了，你也许会想，把这240个留下，其他统统干掉，不就大功告成了吗？
7 V& ^* s: F; r7 x4 O' l/ L可惜，事情并没有那么简单。
在细菌中，存在这样一种情况：比如细胞携带两个基因，A和B，它们都可以合成糖分。无论缺失了A或B，尚存另外一个同伴都会完成“逝去者”的任务——在这种情况下，A或B很容易被各自当成无关紧要的基因。但当A和B同时不在时，糖分的生产可就成了大问题了。而在一些情况下，这些问题是会致命的。
为了解决这一难题，文特尔等人做了这样的设计：他首先将Syn1.0分割成8段（标记为Syn1.0 1-8），按照上面的数据删除这个片段上几乎所有的非必需基因，得到另外一组精简过的基因组（标记为RGD1.0 1-8）。然后，依次用RGD版的基因组片段置换对应的Syn版，检查是否能够得到具有稳定遗传功能的基因组。
& J3 r' u8 u  x他们最终发现，RGD1.0的2，6，7，8号基因序列和Syn1.0的1，3，4，5这8段基因拼合回一起，能够得到可用的基因组。
由于Syn1.0和RGD1.0的序列都是已知的，经过比较，研究者很快找到RGD1.0的1，3，4，5中有哪些基因是被误删的必需基因。按照这样的思路，研究人员很快得到了RGD2.0版基因组。随着一层一层的优化，研究人员最终得到了Syn2.0——它是由RGD2.0的7段基因片段，和Syn1.0的1段基因片段组成的基因组。把Syn2.0移植到山羊支原体的细胞中，辛西娅2.0能够在培养基中存活和繁殖。
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Syn2.0设计、合成示意图。图片来源：本文作者绘制
3 H) E' r( y( j8 E看回Syn2.0的基因组的大小，研究者发现它跟Syn1.0比起来“精简”了几乎一半。再看基因数目，这个长为576kbp的基因组中携带的基因只有512个，比生殖支原体的基因组还小！至此，“人造生命”辛西娅2.0成为了拥有最小基因组的、可以自行繁殖的细胞。
辛西娅3.0：谜团重重的生命“基石”文特尔和他的同事并没满足于Syn2.0取得的成果。在得到稳定繁殖的Syn2.0后，他们又开始用之前建立的做更进一步的精简——在这一步的筛选中，曾经被分类为“半必需”的基因在新的遗传背景下成为了非必需基因。最终，他们成功得到了一个仅仅含有473个基因，基因组大小为531kbp的JCVI-syn3.0（以下简称Syn3.0）。
相比于Syn1.0，在Syn3.0中，所有可动遗传因子（一般用于细菌间的DNA交换）和用以分解酰基甘油产生营养的代谢酶“全军覆没”，相对不那么重要的脂蛋白以及用于非糖类代谢和运输的元件也被删掉了大半。而与DNA保存复制和蛋白质合成等相对关键的基因则几乎被全数保留了下来。而与Syn1.0相比，由于缺乏了与生长相关的基因，Syn3.0的复制相对较慢——大约三个小时才能完成一次分裂，是Syn1.0的三倍。
# W2 B1 L* [+ O- l目前来说，Syn3.0是最接近文特尔苦苦追寻的“生命基石”的基因组。在这个基因组中，48%的基因与基因组信息的维持与表达有关；35%的基因与细胞膜及细胞代谢有关；而有17%的基因，人们目前并不清楚它们所归属的功能大类——如果要明确到具体功能，难以说清的基因则多达149个（约占基因组的31%）。

! I) s- M- T  n; g1 {在Syn3.0的473个基因中，159个基因与基因组信息的表达（蓝色）有关，34个基因与基因组信息的维持（红色）有关。84个基因涉及细胞膜结构和功能（红色）；81个基因设计细胞代谢（紫色）。79个基因的功能则无法归类（蓝绿色）。图片来源：参考文献[1]
8 m* @& R4 r' E. w, B1 P1 M: l此外，Syn3.0的形态与Syn1.0也有较大的差别：在显微镜下，Syn1.0单独分布，而Syn3.0则聚集成团。构成这种差异的原因也还是个谜。“即使辛西娅没有任何其他用途，能让我们知道自己缺了这三分之一的重要知识，也已经是非常关键的成果。”文特尔说。

) p9 G: C+ v+ {( w6 N# g6 J( w显微镜下的Syn1.0与Syn3.0。相比于“独立”的Syn1.0，Syn3.0更倾向于“抱团”。图片来源：参考文献[1]
“生命更像是一个交响乐团而非一个短笛独奏家。”文特尔在接受采访时表示，构建Syn3.0的过程，提示他们需要试着建立一种以基因组为中心的生命观，从整个基因组的视野去看基因的功能。
赫钦森则从辛西娅的谜团想到了人类：“在这最基础不过的细胞中，我们都只了解基因组中三分之二的基因，要是说到人类基因组，我们的了解可能只到1%的水平。这也是为什么我觉得现在说编辑人类基因组还为时过早——我们先得了解更多。”
辛西娅4.0：没到最小，还有更小在此之后，还会有更简版的辛西娅4.0吗？“我们当然希望能够有。”文特尔对科学人说，“我们正在努力找出这些基因的功能。很重要的一点是，我们希望能达到100%了解这种生物钟的基因，而不仅仅是69%。”
$ u% @$ p7 H% t+ G6 L值得一提的是，辛西娅3.0也好，未来或许出现的辛西娅4.0也罢，都只是专属于特定实验室培养条件下，辛西娅这种微生物的最小基因组，而不是所有生物共通的“最简版”。文特尔说：“对不同的生物细胞用使用这套方法，你会得到许多不同的‘最小基因组’。”相同的是他们用于精简基因组的思想：设计-制造-测试-再设计的循环（Design-Build-Test Cycle）。这个流程在过去五年的实验中表现出了强大的效能，在未来可能成为定制基因组的有力工具。
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! ?+ Q" c' p( a# B/ G文特尔的“设计-制造-测试”循环。在这个循环中，研究者要做的是设计好自己的基因组，合成相应的基因序列，利用酵母作为宿主构建出完备的基因组。最终在相应的宿主（本例中是支原体）完成筛选。在实验中，文特尔研究组利用这样的流程对RGD1.0基因组与Syn1.0基因组拆分组合进行了测试，并最终得到了可用于进一步实验的基因组。图片来源：参考文献[1]
目前的研究也为科学家们提供了宝贵的认识：此前构建基因组时一些被认作“不可更改”的铁律，似乎并没有那么严格：在从Syn1.0到Syn3.0的过程中，为了优化基因的表达，文特尔团队对基因组片段2上基因的顺序进行了重排，最后依然得到了有功能的基因。这提示基因组中基因的次序总得来说并不是太关键。这项研究的过程与讨论，后来都被总结在论文当中[1]，发表在今天的《科学》杂志上。
结语还记得让小时候玩的乐高积木吗？城堡、森林、乐园……你可以用积木制造出几乎任何场景——只要将它们加载在那个绿色或黑色的底板上。对于很多合成生物学家来说，像搭建积木一样搭建属于自己的细胞，是他们毕生所追逐的东西。生命科学发展已经使得他们能将各式各样的基因作为自己的“积木”，而他们仍然缺少一块黑色底板——搭载一切伟业的基石。
而现在，文特尔团队所追寻的“最小基因组”，正引领着生物学家逼近这块底板的真容。在我们窥得生命基石全貌的那一瞬间，无数的可能性也就得以迸发出来。

文特尔的团队。图片来源：J. Craig Venter Institute
尽管现在的辛西娅还显得粗糙，还藏着太多谜团，但我们应当对此抱以期待。像承载着城堡、跑车和机器人的乐高积木底板一样，这个小小的支原体也将承载起生物学家奇幻而瑰丽的想象力。在遥远的未来，人们也许会构建出新的菌落、新的植物、新的动物——还有更新的未来。不管你喜不喜欢，这扇通向未来的门已经悄无声息地打开了。而探索的人，正一步不停地向门的另一头走去。


5 m+ q2 h5 L: m# Q% o+ I2 I作者：S.西尔维希耶
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